手上沾到了考的处理方法: 考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合,反应快速,并且稳定,无法用普通试剂洗掉考马斯亮蓝法测蛋白质含量。待一两周左右,皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1 000μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 考马斯亮蓝有G-250和R-250两种。其中考马斯亮蓝G-250由于与蛋白质的结合反应十分迅速,常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应虽然比较缓慢,但是可以被洗脱下去,所以可以用来对电泳条带染色。
实验十四 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
一、 目的
学习和掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。
二、原理
考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1 000μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
二、 材料、主要仪器和试剂
1.实验材料
新鲜绿豆芽
2.主要仪器
(1)分析天平、台式天平
(2)刻度吸管
(3)具塞试管、试管架
(4)研钵
(5)离心机、离心管
(6)烧杯、量筒
(7)微量取样器
(8)分光光度计
3.试剂
(1)牛血清白蛋白标准溶液的配制:准确称取100mg牛血清白蛋白,溶于100mL蒸馏水中,即为1 000μg/mL的原液。
(2)蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制:称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50mL 90%乙醇中,加入85%(W/V)的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。
(3)乙醇
(4)磷酸(85%)
四、操作步骤
1.标准曲线制作
(1)0~100μg/mL标准曲线的制作:取6支10mL干净的具塞试管,按表1取样。盖塞后,将各试管中溶液纵向倒转混合,放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色,记录各管测定的光密度OD595nm,并做标准曲线。
表1 低浓度标准曲线制作
管 号
1
2
3
4
5
6
1 000μg/mL标准蛋白液(mL)
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
蒸馏水(mL)
1.00
0.98
0.96
0.94
0.92
0.90
考马斯亮蓝G-250试剂(mL)
5
5
5
5
5
5
蛋白质含量(μg)
0
20
40
60
80
100
OD595nm
(2)0~1 000μg/mL标准曲线的制作:另取6支10mL具塞试管,按表2取样。其余步骤同(1)操作,做出蛋白质浓度为0~1 000μg/mL的标准曲线。
表2 高浓度标准曲线制作
管 号
7
8
9
10
11
12
1 000μg/mL标准蛋白液(mL)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水(mL)
1.00
0.8
0.6
0.4
0.2
0
考马斯亮蓝G-250试剂(mL)
5
5
5
5
5
5
蛋白质含量(μg)
0
200
400
600
800
1 000
OD595nm
2.样品提取液中蛋白质浓度的测定
(1)待测样品制备:称取新鲜绿豆芽下胚轴2g放入研钵中,加2mL蒸馏水研磨成匀浆,转移到离心管中,再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵,洗涤液收集于同一离心管中,放置0.5~1h以充分提取,然后在4 000r/min离心20min,弃去沉淀,上清液转入10mL容量瓶,并以蒸馏水定容至刻度,即得待测样品提取液。
(2)测定:另取2支10mL具塞试管,按下表取样。吸取提取液0.1mL(做一重复),放入具塞刻度试管中,加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂,充分混合,放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色,记录光密度OD595nm,并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X(μg)。以标准曲线1号试管做空白。
表3 待测液蛋白质浓度测定
管 号
13
14
蛋白质待测样品提取液(mL)
0.1
0.9
5
0.1
0.9
5
蒸馏水(mL)
考马斯亮蓝G-250试剂(mL)
OD595nm
蛋白质含量(μg)
五、结果计算
X×
提取液总体积(mL)
样品蛋白质含量(μg / g鲜重)=
测定时取样体积(mL)
样品鲜重(g)
式中:X为在标准曲线上查得的蛋白质含量(μg)。
六、附 注
1.Bradford法由于染色方法简单迅速,干扰物质少,灵敏度高,现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
2.有些阳离子,如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定,但大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定。
3.蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速,在2min左右反应达到平衡;其结合物在室温下1h内保持稳定。因此测定时,不可放置太长时间,否则将使测定结果偏低。
七、思考题
1.制作标准曲线及测定样品时,为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合?
参考答案
1.将各试管中溶液纵向倒转混合目的是使反应充分,并且使整个反应液均一,否则在比色测定时,结果会有较大偏差,使标准曲线的制作不标准,后续的测定结果就不可靠。