如何设计引物,如何设计扩增基因全长的引物

其实要看你的目的,如果你是要扩增基因组的基因的话,那你就去ncbi-genome上面找到你要研究的那段基因,如果基因不太长1kbp以内的话,那就可以直接选取两头约20bp的片段设计互补引物。如果基因太长了,那就设计多段引物,一段一段把基因pcr出来再连在一起。如果你要扩增的是cDNA的话,也就是蛋白质的cDNA序列的话,就去ncbi-gene里面找到相应蛋白质的序列,再设计引物,以cDNA文库位模版把目标基因给pcr出来。希望回答能够帮助到你:D

如何设计引物,如何设计扩增基因全长的引物

1、引物长度一般为15-30bp,常用的为18-27bp,但不能大于38bp;

2、引物GC含量一般为40%-60%,以45-55%为宜,上下游引物GC含量和Tm值要保持接近;

3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右,至少要在55-80℃之间,Tm值曲线以选取72度附近为佳,5’到 3’的下降形状也有利于引物与模板的结合;

4、ΔG值(自由能)反应了引物与模板结合的强弱程度,3’端的ΔG值相对要低,且绝对值不要超过9,否则不利于正确引发反应,3’末端双链的ΔG值在0–2kcal/mol时,PCR产量几乎达到百分之百,但在-6时只达到40%,-8时少于20%,-10时接近于0;

5、错配率一般不要超过100,否则会出现非目的条带。但对于某些特定的模板序列,还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大,比如在正确位点的引发效率为340以上,而在错误位点的引发效率为110,并且不好找到其他更合适的引物,那么这对引物是可以接受的;

6、Frq曲线为Oligo6软件新引进的一个指标,解释了序列片段存在的重复几率大小,选取引物时,应该用Frq值相对较低的片段;

7、引物二聚体及发卡结构的能量的绝对值一般不要超过4.5,否则容易产生引物二聚体而且会降低引物浓度从而导致PCR不能正常发生;

8、3’端最好不要是连续碱基,GGG或CCC会导致错误的引发,同时3’端最后一个碱基最好不要是A或T,若是,会导致错配;

9、以公式Tm=4*(G+C)+2*(A+T)-5计算Tm值,也就是退火温度。选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度,最好保证每个引物的Tm值相匹配,且在70-75℃范围内;

10、模板与稳定性较小的引物之间的Tm的差异越小,PCR的效率越高。因为解链温度也取决于它的长度,如果期待的产物长度等于或小于500bp,选用端的引物(16-18bp),如果产物长5kb,则用24bp的引物;

11、在DNA测序和PCR中最好用5’末端稳定(GC含量多),而3’端不稳定(AT含量多)的引物,这种引物的结构可以有效地消除假引发反应;

12、引物和产物之间的Tm值相差别太大,20摄氏度范围内最好。

13、对引物的修饰一般在5’端进行,例如加酶切位点,加酶切位点的同时要根据需要添加保护碱基。

设计引物原则

(1)引物最好在模板cDNA的保守区内设计;

(2)引物长度一般在15~30碱基之间,过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应;

(3)引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度,一般计算公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值;

(4)引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性;

(5)引物应具有特异性。引物设计完成以后,应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性,就可以进行下一步的实验了;

(6)引物扩增长度:一般RT-PCR引物扩增长度在100-200bp,常规PCR扩增长度建议200-500bp。一般PCR产物达到2-3k长度也是可以的,但要考虑到可能引入突变,因此建议使用高保真的聚合酶。

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